PNAS：中国学者揭示一种噬菌体抵抗宿主防御的机制

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7月26日，中国科学院生物物理研究所王艳丽团队在PNAS杂志在线发表论文，揭示了噬菌体anti-CRISPR蛋白AcrIIC4抑制宿主Cas9监测复合物切割双链DNA活性的分子机制。

噬菌体是以原核生物为宿主的病毒，作为地球上数量最庞大的生物群体，对维持地球生态系统的有序运行意义重大。在噬菌体和宿主漫长的军备竞赛中，为抵御噬菌体的入侵，原核生物进化出了多种系统进行防御，例如限制修饰系统、CRISPR-Cas系统，以及近来不断涌现的多种引起流产感染的系统等。其中，CRISPR-Cas系统是已知的唯一一种适应性免疫系统。相应的，噬菌体进化出了anti-CRISPR蛋白抑制Cas蛋白的切割，从而保持自身基因组完整。

在已知的两大类六种类型CRISPR-Cas系统里，第二大类II型的Cas9效应蛋白已被广泛应用于基因编辑。针对Cas9的anti-CRISPR蛋白也不断被鉴定。对这些蛋白抑制机理的阐释，不仅可以增进人们对噬菌体与宿主间相互竞争关系的理解，而且有助于后续基因编辑工具的开发。

AcrIIC4也是一种anti-CRISPR蛋白，它在基因编辑过程中能高效抑制Cas9的活性，具有被开发为基因编辑调控工具的潜力。然而，由于缺乏AcrIIC4和Cas9复合物的结构，AcrIIC4发挥抑制的精确机制还不明确，而且在其能否阻止DNA结合方面存在争议。

为此研究人员解析了Cas9，向导RNA (sgRNA)，AcrIIC4和靶标DNA之间的一系列结构，发现AcrIIC4结合到Cas9的两个识别结构域REC1和REC2之间，并与sgRNA建立了广泛相互作用，这样能限制住柔性较大的REC2结构域的运动。结构比较发现，有AcrIIC4存在时，靶标链(TS)和sgRNA只能形成七个碱基的异源双链配对，R-loop的形成被阻止在中间步骤。这与生化实验证据相印证：AcrIIC4能降低、但不完全阻止Cas9与DNA的结合。

进一步实验证明，AcrIIC4能阻止双链DNA在PAM远端解链，并对TS-guide RNA结合通道的形成有影响，从而阻止完整R-loop的形成，终止后续别构激活。此外，AcrIIC4抑制II-C型Cas9不同同源蛋白的能力差异较大。该研究通过一级序列和三维结构比对，结合体外切割实验，证明了sgRNA的第一个茎环长度的不同是导致这种差异的原因。这一发现对在不同Cas9编辑系统中应用AcrIIC4具有指导意义。

相关论文链接：：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2303675120